Obsah
Lise je řecké slovo a jednoduše znamená „rozdělit“ nebo „rozložit“. Je to dobrý popis reakce, ke které dochází u buněk v lyzačním pufru, což je řešení, které je rozdělí a extrahuje jejich obsah. Vědci používají tato řešení k extrakci DNA nebo proteinů při buněčné analýze, zejména v případě bakterií. Typ pufru pro lýzu buněk se liší v závislosti na typu experimentu, nicméně uvedeme několik běžných možností.
Pufr a sůl
Roztoky pufru stabilizují pH, zatímco buňky procházejí procesem lýzy. Roztok tris-HCL je nejběžnějším pufrem pro pufrování při pH 8, pokud je požadováno pH. HEPES je dalším běžným pufrovacím roztokem v těchto experimentech. Může se také přidat chlorid sodný ke zvýšení iontové síly, celkové koncentrace rozpuštěných látek mimo buňky. To je důležité, protože voda se může šířit do všech buněčných membrán, z oblastí s nízkou koncentrací rozpuštěné látky do oblastí s vysokou koncentrací.
Čisticí prostředek
Detergent je hlavní složka, která rozpouští buněčnou membránu tak, aby obsah mohl uniknout. Detergenty jsou amfipatické molekuly, tj. S jedním koncem, který snadno interaguje s molekulami vody, zatímco druhý hydrofobní konec, neboli „který se bojí vody“, tuto interakci neprovádí. Mohou rozpouštět tuky tvorbou micel, malých skupin, ve kterých hydrofobní ocasy molekul detergentu směřují dovnitř k molekulám tuku. Běžnými detergenty jsou dodecylsulfát sodný nebo SDS, NP-40 a tritonX.
Chelatační činidla a inhibitory
Lyzační pufry obvykle také obsahují chelatační činidla, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) nebo kyselina retylenglykoltetraoctová (EGTA). Tyto chemikálie se vážou na ionty kovů s nábojem +2 (například hořčík a vápník), čímž jsou nedostupné pro další reakce. Mnoho DNAza (proteiny, které žvýkají DNA) a proteázy (proteiny, které štěpí jiné proteiny) potřebují ionty hořčíku, aby fungovaly, takže zbavením této hlavní složky, EDTA a EGTA, pomáhají snižovat hladinu proteázy nebo aktivity DNAsy. Nevylučují je však úplně a některé proteázy nezávisí na kofaktorech hořčíku, takže lyzační pufry někdy obsahují také látky zvané inhibitory proteázy, které se na ně vážou a brání tomu, aby správně fungovaly.
Alkalická lyza
Alkalická lýza je velmi běžná technika čištění plazmidů z bakterií. Tato metoda předpokládá použití tří řešení. První obsahuje glukózu, pufr tris-HCL, EDTA a RNAsy. Glukóza vytváří vysokou koncentraci solutů mimo bakterie, takže se stávají mírně ochablými, což usnadňuje proces lýzy. EDTA a tris-HCL fungují, jak bylo popsáno výše, zatímco RNAse bude žvýkat jakoukoli RNA uvnitř buňky, aby ji odstranila z cesty. Druhé řešení účinně lýzuje buňky. Obsahuje detergent SDS a NaOH, které zvyšují pH na 12 nebo vyšší, denaturují proteiny uvnitř buňky a způsobují, že se DNA rozdělí na jednoduchá vlákna. Třetí roztok obsahuje octan draselný pro obnovení pH na neutrálnější úroveň, aby se mohly řetězce plazmidové DNA spojit. Mezitím se denaturované proteiny spojí a vysráží, zatímco dodecylsulfátové ionty se spojí s draselnými ionty a vytvoří nerozpustnou sloučeninu, která se také může vysrážet z roztoku.