Obsah
Techniky elektroforézy oddělují molekuly DNA na základě jejich velikosti; podobné techniky pro proteiny je mohou oddělit na základě velikosti nebo náboje. V obou případech se připravuje gel, kterým molekuly migrují, za použití pufrového roztoku, chemické látky, která stabilizuje pH. Víčko plní v elektroforéze několik životně důležitých rolí.
Proud
Gél pro elektroforézu funguje tak, že se do ponořené gelové desky v pufru aplikuje elektrický proud. Molekuly DNA jsou záporně nabité a proteiny mohou být záporně nabity tak, že je nejprve denaturují, a pak je ošetřují dodecylsulfátem sodným (SDS). Proteiny nebo molekuly DNA migrují z negativně nabité katody na kladně nabitou anodu. Voda je však v současné době spíše chudým vozidlem - přenáší proud účinně pouze tehdy, když v něm rozpouští látky, protože nabité ionty se pohybují v elektrickém poli. Pufrový roztok má vyšší koncentraci iontů (vyšší iontovou sílu), takže může přenášet mnohem více proudu než čistá voda.
Změna PH
Hodnota pH měří koncentraci iontu vodíku. Změna pH může změnit čistý náboj molekul, jako je protein nebo DNA, což způsobuje pomalejší (nebo rychlejší) migraci. To proto, že tyto molekuly mají základní části, které přijímají vodíkové ionty (protony) a mnoho kyselých částí, které mohou darovat protony. Když kyselina daruje proton, stane se záporně nabitou; když základna přijme proton, naopak dostane kladný náboj. Jak se zvyšuje koncentrace vodíkových iontů v roztoku, proteiny a DNA jsou méně negativně nabity (nebo pozitivněji nabity). Hodnota pH, při které molekula, podobně jako protein, nemá náboj, se nazývá izoelektrický bod. Pufry stabilizují pH v gelu na úrovni, kde bude DNA záporně nabitá a bude migrovat podle potřeby.
Stohovací gel
Pufry hrají ještě složitější roli v druhu elektroforézy nazvané SDS-PAGE, nebo dodecylsulfátu sodného, elektroforézy na polyakrylamidovém gelu. To je jedna z nejběžnějších metod analýzy proteinů. Jsou denaturovány tepelným zpracováním a poté potaženy dodecylsulfátem sodným a pak jsou přidány do gelu, který obecně probíhá vertikálně. Gel má dvě oblasti, jednu na sebe (v nadřazené části) a druhou na spodní. Stohovací gel je připraven s jiným pufrem, takže jeho pH je nižší než pH běžícího gelu, navíc má menší iontovou sílu. Tyto dva faktory způsobují navrstvení proteinu, takže to vše je v běžícím gelu současně. Tento efekt pomáhá zajistit separaci proteinů v gelu podle jejich velikosti.
Elektroforéza Cap DNA
Dva nejběžnější pufry pro DNA gelovou elektroforézu jsou tris-acetát EDTA a tris-boritan EDTA, kde EDTA znamená kyselinu ethylendiamintetraoctovou. Je důležité, protože slouží jako chelatační činidlo pro ionty hořčíku a odstraňuje je z roztoku. Tyto ionty jsou esenciálními kofaktory pro enzymy nazývané DNA, které rozbíjejí DNA, takže EDTA v pufru funguje jako zvláštní opatření k prevenci jakýchkoli problémů s DNA.