Obsah
- Detekce pomocí barevných změn
- Použití ELISA čtečky pro měření
- Přímá kompetitivní ELISA (cytochrom c)
- Inkubujte primární protilátku ve zkumavkách
Test ELISA je imunosorbentní test spojený s enzymem, který používá protilátky nebo antigeny spojené se specifickým enzymem k určení koncentrace protilátky nebo antigenu. Pokud užíváte ELISA a nemůžete použít specifické protilátky k získání vašich výsledků, doporučuje se kompetitivní ELISA, protože používá antigen konjugovaný s enzymem namísto protilátky a odlišnou detekční metodou.
Detekce pomocí barevných změn
Společným protokolem pro kompetitivní ELISA je použití neznačené a purifikované primární protilátky. Protilátka potahuje jamky mikrotitrační destičky a inkubuje se s neznámými standardy. Pak se přidá imunogen k konjugaci s primární protilátkou, která se bude vázat na místa protilátek, která ještě nejsou obsazena. Substrát se pak použije k vytvoření změny barvy pro měření koncentrace vazby.
Použití ELISA čtečky pro měření
Použijte mikrotitrační polystyrenovou destičku a přidejte primární protilátku do každé jamky. Pro dosažení maximální vazby naplňte jamku jedním mikrogramem protilátky. Destička se inkubuje po dobu čtyř hodin při teplotě místnosti. Přidá se primární zachycovací protilátka a jamky se promyjí PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok). Destičky inkubujte s blokovacím pufrem po dobu dvou hodin při pokojové teplotě. Jamky dvakrát promyjte PBS a přidejte standardy. Roztok antigen-konjugát se umístí do jamek a znovu se inkubuje po dobu dvou hodin. Destička se čtyřikrát promyje PBS. Přidá se substrát a změří se hustoty při specifické vlnové délce pomocí čtečky ELISA.
Přímá kompetitivní ELISA (cytochrom c)
Pro přímý kompetitivní test ELISA musí být provedena analýza ředění séra pro antigen, který používáte v experimentu. Mikrotitrační destička je potom potažena cytochromem c a inkubována přes noc. Část testu ELISA se pak provede přidáním blokovacího činidla a sekundární protilátky. Výsledky absorbance jsou odečítány pomocí čtečky mikrodestiček.
Inkubujte primární protilátku ve zkumavkách
V tomto postupu se primární protilátka inkubuje ve zkumavkách, ve kterých se k ní váže požadovaný antigen. Vzorky se potom přidají do jamek mikrotitračních destiček a inkubují se. Jamky se potom promyjí, aby se odstranily všechny nenavázané komplexy antigen-protilátka, a pak se přidá blokovací roztok, aby se zabránilo vazbě druhé protilátky na jamky. Sekundární protilátka se pak odečte na čtečce destiček, aby se získali výsledky.